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質(zhì)粒DNA 的分離、純化和鑒定
.概述
質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb 不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA 分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開(kāi)宿主細(xì)胞則不能存活，而宿主即使沒(méi)有它們也可以正常存活。
.概述
質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb 不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA 分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開(kāi)宿主細(xì)胞則不能存活，而宿主即使沒(méi)有它們也可以正常存活。
質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對(duì)抗生素的抗性等。F 質(zhì)粒(又稱F 因子或性質(zhì)粒)、R 質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col 質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見(jiàn)的天然質(zhì)粒。
質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型:緊密控制型(Stringent control)和松馳控制型(Relaxedcontrol)。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí)，它也不能復(fù)制，通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1 個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子，如F 因子。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制，在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝，一般在20 個(gè)以上，如Col E1 質(zhì)粒。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑-氯霉素時(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA 復(fù)制和細(xì)胞分裂均受到抑制，緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止，而松馳型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制，質(zhì)粒拷貝數(shù)可由原來(lái)20 多個(gè)擴(kuò)增至1000-3000 個(gè)，此時(shí)質(zhì)粒DNA 占總DNA 的含量可由原來(lái)的2%增加至40-50%。
質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型:緊密控制型(Stringent control)和松馳控制型(Relaxedcontrol)。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí)，它也不能復(fù)制，通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1 個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子，如F 因子。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制，在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝，一般在20 個(gè)以上，如Col E1 質(zhì)粒。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑-氯霉素時(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA 復(fù)制和細(xì)胞分裂均受到抑制，緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止，而松馳型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制，質(zhì)粒拷貝數(shù)可由原來(lái)20 多個(gè)擴(kuò)增至1000-3000 個(gè)，此時(shí)質(zhì)粒DNA 占總DNA 的含量可由原來(lái)的2%增加至40-50%。
利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在，當(dāng)兩種質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí)，它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過(guò)程中彼此競(jìng)爭(zhēng)，在一些細(xì)胞中，一種質(zhì)粒占優(yōu)勢(shì)，而在另一些細(xì)胞中另一種質(zhì)粒卻占上風(fēng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)丟失，因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒則可以穩(wěn)定地共存于同一宿主細(xì)胞中。
質(zhì)粒通常含有編碼某些酶的基因，其表型包括對(duì)抗生素的抗性，產(chǎn)生某些抗生素，降解復(fù)雜有機(jī)物，產(chǎn)生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性內(nèi)切酶與修飾酶等。
質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因)和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這些用途包括通過(guò)組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測(cè)定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA 序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達(dá)等。一個(gè)理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)；（3）能插入較大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的檢測(cè)表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb 至10kb 之間，如PBR322、PUC 系列、PGEM 系列和pBluescript（簡(jiǎn)稱pBS）等。
從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA 的方法都包括3 個(gè)基本步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞;分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton X-100 可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS 或Triton X-100 處理后，細(xì)菌染色體DNA 會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA 比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA 變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circularDNA，簡(jiǎn)稱cccDNA)的兩條鏈不會(huì)相互分開(kāi)，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA 片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA 雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。
在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過(guò)程中，除了超螺旋DNA 外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA 兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子，稱開(kāi)環(huán)DNA(Open circular DNA，簡(jiǎn)稱ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA 的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA(Linear DNA)。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA 電泳時(shí)，同一質(zhì)粒DNA 其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開(kāi)環(huán)和線狀分子的泳動(dòng)速度快。
材料、設(shè)備及試劑
一、材料
含pBS 的E. coli DH5α或JM 系列菌株，1.5ml 塑料離心管(又稱eppendorf 管)，離心管架。
二、設(shè)備
微量取液器(20μl，200μl，1000μl)，臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。
三、試劑
1、LB 液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani) ：稱取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml 去離子水中，用NaOH 調(diào)pH 至7.5，加去離子水至總體積1 升，高壓下蒸氣滅菌20 分鐘。
2、LB 固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉，高壓滅菌。
3、氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)母液：配成50mg/ml 水溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>
4、溶菌酶溶液：用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml，并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20℃，每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。
5、3mol/l NaAc (pH5.2)：50ml 水中溶解40.81gNaAc·3H2 O，用冰醋酸調(diào)pH 至5.2，加水定容至100ml，分裝后高壓滅菌，儲(chǔ)存于4℃冰箱。
6、溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15 分鐘，儲(chǔ)存于4℃冰箱。
7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (臨用前用10mol/L NaOH 母液稀釋)，1％SDS。
8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為: K+ 3mol/L，Ac-5mol/L。
9、RNA 酶A 母液：將RNA 酶A 溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5)，15mmol/L NaCl 中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加熱15 分鐘，使混有的DNA 酶失活。冷卻后用1.5ml eppendorf 管分裝成小份保存于-20℃。
10、飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物，這些產(chǎn)物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA 和DNA的交聯(lián)，應(yīng)在160℃用冷凝管進(jìn)行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羥基喹啉(作為抗氧化劑)，并用等體積的0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)緩沖液反復(fù)抽提使之飽和并使其pH 值達(dá)到7.6以上，因?yàn)樗嵝詶l件下DNA 會(huì)分配于有機(jī)相。
11、氯仿:按氯仿:異戊醇＝24:1 體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開(kāi)，異戊醇則可起消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫。按體積/體積＝1:1 混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)戴手套。
12、TE 緩沖液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高壓滅菌后儲(chǔ)存于4℃冰箱中。
13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)，5% TritonX-100。
14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。
15、電泳所用試劑：（1）TBE 緩沖液(5×)：稱取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。（2）上樣緩沖液(6×)：0.25% 溴酚藍(lán)，40% (w/v) 蔗糖水溶液。
操作步驟
一、細(xì)菌的培養(yǎng)和收集
將含有質(zhì)粒pBS 的DH5α菌種接種在LB 固體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中，37℃培養(yǎng)12-24 小時(shí)。
用無(wú)菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB 液體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中，37℃振蕩培養(yǎng)約12 小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。
二、質(zhì)粒DNA 少量快速提取
質(zhì)粒DNA 小量提取法對(duì)于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA 十分有用。這些方法共同特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，能同時(shí)處理大量試樣，所得DNA 有一定純度，可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。
（一）、煮沸法
1、將1.5ml 培養(yǎng)液倒入eppendorf 管中，4℃下12000ｇ離心30 秒。
2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。
3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET 溶液中，渦旋混勻。
4、加入10ml 新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)，渦旋振蕩3 秒鐘。
5、將eppendorf 管放入沸水浴中，50 秒后立即取出。
6、用微量離心機(jī)4℃下12000g離心10 分鐘。
7、用無(wú)菌牙簽從eppendorf 管中去除細(xì)菌碎片。
8、取20ml 進(jìn)行電泳檢查。
[注意] 1. 對(duì)大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，濃度高時(shí)，細(xì)菌裂解效果反而不好。有時(shí)不同溶菌酶也能溶菌。
3. 提取的質(zhì)粒DNA 中會(huì)含有RNA，但RNA 并不干擾進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，如限制性內(nèi)切酶消化，亞克隆及
連接反應(yīng)等。
（二）、堿法
1、取1.5ml 培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf 管中，4℃下12000g離心30 秒。
2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。
3、菌體沉淀重懸浮于100μl 溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩)，室溫下放置5-10 分鐘。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf 管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物(千萬(wàn)不要振蕩)，冰浴5 分鐘。
5、加入150μl 預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10 秒，使沉淀混勻，冰浴中5-10分鐘，4℃下12000g離心5-10 分鐘。
6、上清液移入干凈eppendorf 管中，加入等體積的酚/氯仿(1:1)，振蕩混勻，4℃下12000g離心5分鐘。
7、將水相移入干凈eppendorf 管中，加入2 倍體積的無(wú)水乙醇，振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10 分鐘。
8、棄上清，將管口敞開(kāi)倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g離心5-10 分鐘。
9、吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10 分鐘或室溫干燥。
10、將沉淀溶于20μl TE 緩沖液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，儲(chǔ)于-20℃冰箱中。
[注意] 1. 提取過(guò)程應(yīng)盡量保持低溫。
2. 提取質(zhì)粒DNA 過(guò)程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨(dú)用酚或氯仿好，要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。
3. 沉淀DNA 通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時(shí)間稍長(zhǎng)可使DNA 沉淀完全。沉淀DNA 也可用異丙醇(一般使用等體積)，且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀下來(lái)，所以多數(shù)還是用乙醇。
（三）、Wizard 少量DNA 純化系統(tǒng)
Promega 公司的Wizard 少量DNA 純化系統(tǒng)可快速有效的抽提質(zhì)粒DNA，整個(gè)過(guò)程只需15 分鐘。提取的質(zhì)粒可直接用于DNA 測(cè)序、酶切分析和體外轉(zhuǎn)錄等。
該系統(tǒng)中所含試劑和柱子可以用于50 次1-3ml 質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化，試劑包括10ml 細(xì)胞懸浮液，10ml 細(xì)胞裂解液；10ml 中和液，50ml Wizard 少量DNA 純化樹(shù)脂，50ml 柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml )和50 支Wizard 微型柱。
1、1-3ml 過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞液4℃下12000g 離心1-2 分鐘。
2、去除上清液，菌體細(xì)胞懸浮于200μl 細(xì)胞懸浮液中，充分混合，并移入eppendorf 管中。
3、加200μl 細(xì)胞裂解液，顛倒離心管數(shù)次，直到溶液變清亮。
4、加200μl 中和液，顛倒離心管數(shù)次。
5、4℃下12000g離心5 分鐘，取上清液于新的eppendorf 管中。
6、加1ml Wizard 少量DNA 純化樹(shù)脂，顛倒離心管數(shù)次以充分混勻。
7、取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒與Wizard 微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進(jìn)入微型柱。
8、將注射器與微型柱分開(kāi)，取出注塞，再將注射筒與微型柱相連，加入2ml 柱洗液，并用注塞輕推，使柱洗液進(jìn)入微型柱。
9、取出微型柱置于eppendorf 管中，離心2 分鐘以除去微型柱中的柱洗液。
10、將微型柱放在一個(gè)新eppendorf 管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，靜止1 分鐘后，4℃下12000g離心20 秒。
11、丟棄微型柱，將eppendorf 管中的質(zhì)粒DNA 貯于4℃或-20℃冰箱。
[注意] 樹(shù)脂使用前應(yīng)充分混勻，如有結(jié)晶，可將樹(shù)脂用25-37℃水浴處理10 分鐘。
質(zhì)粒DNA 的大量提取和純化
在制作酶譜、測(cè)定序列、制備探針等實(shí)驗(yàn)中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA，為此需要大量提取質(zhì)粒DNA。大量提取的質(zhì)粒DNA 一般需進(jìn)一步純化，常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。
（一）、堿法
1、取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的含pBS 質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液250ml，4℃下5000g離心15 分鐘，棄上清，將離心管倒置使上清液全部流盡。
2、將細(xì)菌沉淀重新懸浮于50ml 用冰預(yù)冷的STE 中（此步可省略）。
3、同步驟1 方法離心以收集細(xì)菌細(xì)胞。
4、將細(xì)菌沉淀物重新懸浮于5ml 溶液I 中，充分懸浮菌體細(xì)胞。
5、加入12ml 新配制的溶液II，蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心管數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，冰浴10 分鐘。
6、加9ml 用冰預(yù)冷的溶液III，搖動(dòng)離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物，冰上放置15 分鐘，此時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。
7、4℃下5000g離心15 分鐘。
8、取上清液，加入50ml RNA 酶A(10mg/ml)，37℃水浴20 分鐘。
9、加入等體積的飽和酚/氯仿，振蕩混勻，4℃下12000g離心10 分鐘。
10、取上層水相，加入等體積氯仿，振蕩混勻，4℃下12000g離心10 分鐘。
11、取上層水相，加入1/5 體積的4mol/L NaCl 和10% PEG(分子量6000)，冰上放置60 分鐘。
12、4℃下12000g離心15 分鐘，沉淀用數(shù)ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5 分鐘。
13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE 或水中。
[注意] 1. 提取過(guò)程中應(yīng)盡量保持低溫。
2. 加入溶液II 和溶液III 后操作應(yīng)混和，切忌劇烈振蕩。
3. 由于RNA 酶A 中常存在有DNA 酶，利用RNA 酶耐熱的特性，使用時(shí)應(yīng)先對(duì)該酶液進(jìn)行熱處理(80℃1 小時(shí))，使DNA 酶失活。
（二）、Wazard 大量DNA 純化系統(tǒng)
堿法大量提取DNA 往往需要很長(zhǎng)的時(shí)間.Promega 公司的Wiazrd 大量DNA 純化系統(tǒng)既簡(jiǎn)單又快速，只需要離心和真空抽干，這個(gè)系統(tǒng)可以從500ml 培養(yǎng)液中在3 小時(shí)以內(nèi)獲得1mg 以上的高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA(200-20000bp)。該系統(tǒng)不需要酚和氯仿抽提，純化后的DNA 溶于水或TE 緩沖液中，不含任何鹽份，可以直接用于DNA 序列分析和酶切反應(yīng)，也可以用于在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等。
該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可以用于10 次100-500ml 質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化，試劑包括: 150ml 細(xì)胞懸浮液，150ml 細(xì)胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA 純化樹(shù)脂，125ml Wizard柱子洗脫溶液和10 支Wizard 帶有存儲(chǔ)離心管的柱子。
1、100-500ml 細(xì)胞培養(yǎng)液置離心管中，22-25℃下5000g 離心10 分鐘，所得細(xì)胞沉淀充分懸浮于細(xì)胞懸浮液中。
2、加15ml 細(xì)胞裂解溶液并輕輕混合，可以反復(fù)倒置混合，但不能用渦旋振蕩，細(xì)胞裂解完全時(shí)，溶液會(huì)變清，這一步需要20 分鐘。
3、加15ml 中和溶液，立即反復(fù)倒置離心管數(shù)次，并使之混勻。
4、14000g，22-25℃離心15 分鐘。
5、小心地將上清液吸出并移至一個(gè)新離心管中。
6、加0.5 倍體積的異丙醇，混合均勻，14000g 22-25℃下離心15 分鐘。
7、棄上清，懸浮DNA 沉淀于2ml TE 緩沖液中。這一步中也許有的沉淀不能溶解。
8、加10ml Wizard 大量DNA 純化樹(shù)脂溶液，并渦旋混合。
9、每一個(gè)樣品，使用一支Wizard 大量柱子，柱子的頭插在真空器上(Promega 產(chǎn)品，與此配套)。
10、將樹(shù)脂/DNA 混合液轉(zhuǎn)入柱子中，真空抽取樹(shù)脂/DNA 混合液。
11、將樹(shù)脂/DNA 混合液抽干后，加13ml 柱子洗脫溶液至離心管中，對(duì)管底部的樹(shù)脂/DNA 進(jìn)行洗脫(柱子一邊旋轉(zhuǎn)一邊加入洗脫液)，并加入柱子中。
12、真空抽干所加入的洗脫。
13、再加12ml 柱子洗脫液進(jìn)柱子并抽干。
14、加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的樹(shù)脂，柱子真空抽干后將柱子放入用戶提供的離心管中，2500rpm(1300g)離心5 分鐘。
15、取出柱子，真空抽干5 分鐘，再將柱子放入系統(tǒng)中所提供的離心管中，2500rpm(1300g)離心5 分鐘。
16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃預(yù)熱過(guò)的滅菌重蒸水或TE，1 分鐘后2500rpm(1300g)離心柱子/離心管5 分鐘。
17、取出柱子，離心管中溶液即為提取的質(zhì)粒DNA，可以直接放在離心管中，蓋上蓋子，儲(chǔ)存在4℃或-20℃備用。
[注意] 1. 在使用之前，系統(tǒng)所提供的柱子洗脫液按1:1 加入125ml 95％乙醇。
2. 純化樹(shù)脂必須混勻后再用.
（三）、Sephrose 2B 柱純化質(zhì)粒DNA
堿法提取的質(zhì)粒DNA 即使用RNA 酶處理，仍會(huì)含有少量RNA。當(dāng)有些試驗(yàn)需無(wú)RNA 污染的DNA制品時(shí)，則需進(jìn)行進(jìn)一步純化。一般常用Sepharose 2B 或Sepharose 4B 進(jìn)行純化，該方法具有快速，條件溫和，重復(fù)性好，載體物質(zhì)可以再利用等優(yōu)點(diǎn)，因而已廣泛用于質(zhì)粒DNA 純化。
1、將Sepharose 2B 經(jīng)含0.1% SDS 的TE（pH8.0）平衡后上柱。
2、將至多1ml 的DNA 溶液鋪在Sepharase 2B 柱上。
3、待DNA 溶液完全進(jìn)入柱內(nèi)后立即在柱的上部連接含有0.1% SDS 的TE(pH8.0)貯液瓶。
4、以1ml 流出液為1 份進(jìn)行收集。
5、對(duì)每一管測(cè)定其OD260 值，以確定哪些管中含有質(zhì)粒DNA。通常質(zhì)粒DNA 在柱上流出的第一個(gè)峰中。
6、合并所有含質(zhì)粒的洗脫液，用等體積的酚/氯仿(1:1)抽提，4℃下12000g離心2 分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)入新管。
7、加入2 倍體積的冰冷無(wú)水乙醇，-20℃下沉淀10 分鐘，然后4℃下12000g離心10 分鐘，棄去上清液。
8、沉淀加70%乙醇洗滌，4℃下12000g離心10 分鐘，棄去上清液。
9、沉淀真空抽干，重新溶于TE 或無(wú)菌水中。
[注意] 在裝柱過(guò)程中，要防止柱床中出現(xiàn)斷裂或氣泡現(xiàn)象，要使界面保持平整。對(duì)新裝成的柱，應(yīng)用含0.1% SDS 的TE 平衡，以使柱內(nèi)的凝膠均勻。
